CORONAVIRIDAE - LES CORONAVIRUS

d'après le cours de Luis ENJUANES, Departement of Molecular and Cell Biology,
CNB, Campus Universidad Autonoma Cantoblanco, Madrid, SPAIN

INTRODUCTION

L'ordre des Nirovirales inclus 3 familles virales : les Coronaviridae (Coronavirus), les Arteriviridae et, probablement bientôt, les Ronoviridae, une variété de virus ayant une forme de baguette (rod en anglais) infectant les invertébrées tel que les crevettes.

Les Coronaviridae comprennent les genres Coronavirus et Torovirus. Les points communs et les divergences de ces 2 genres sont les suivantes:

I- PROPRIETES BIOLOGIQUES

Les Coronavirus (appelé ainsi car présentant une forme de couronne ou corona) infectes les oiseaux et beaucoup de mammifères, y compris les humains. La trachée respiratoire, les organes gastro-intestinaux, ainsi que les tissus neurologiques sont les cibles les plus fréquentes des coronavirus, mais d'autres organes incluant le foie, le coeur, les reins et les yeux peuvent êtres également affectés (Escor et al., 2001). Les cellules épithéliales sont les cibles principales des coronavirus (Alonso et al.). Les cellules largement ditribuées telles que les macrophages sont aussi souvent infectés par les coronavirus. Ces virus sont relativement restreint dans leur spectre d'hôte, infectant seulement leur hôte naturel, et des espèces animales relativement proche. Occasionnellement, l'infection par le coronavirus passe la barrière d'espèce , comme lors d'infection de dindon par le coronavirus bovin (BCoV), ou l'infection expérimentale de chien par le TGEV. C'est peut être ce qu'il s'est passé avec la SRAS (Syndrome Respiratoire Aigüe Sévère). Les vecteurs biologiques sont inconnus. Les transmissions par respiration, fécal et oral sont courantes.
Les infections de l'homme et des animaux par les coronavirus semblent êtres ubiquitaires, car l'évidence de l'infection a été obtenue dans tous les pays où des études sérologiques et virologiques ont été effectuées.

II- MORPHOLOGIE

Les Coronavirus tire leurs noms de leur forme caractéristique en couronne (Corona en latin):

Coronavirus (tiré du site du département de Penn State Biology )

Les virons sont enveloppés et de forme sphérique; certain Coronavirus font couramment 120-160nm de diamètre avec un coeur interne , parfois icosaédrique, de 65nm, et une nucléocapside en hélice..

Figure 1: Représentation schématique d'un coronavirus

Les coronavirus et les toronovirus ont tous deux de larges projections à leurs surfaces formées de glycoprotéines possédant un globule et une portion fine. Les peplomers (trimère de spicule) ont environ 20nm de long chez les coronavirus et légèrement plus petit chez les torovirus. Chez certain coronavirus comme le BCoV et le virus de l'hépatite murin (MHV), une seconde couche de peplomers formée par des protéines Hémaglutinine Estérase (HE) est également observée (Escors et al., 2001).
Un vide séparant le core interne de l'enveloppe a été observé chez les Coronavirus en utilisant le microscopie à cryoelectron. Le Core peut être isolé après traitement. La décompositions de ces cores révèle des nucléocapsides contenant des hélices de N-protéines.

III- LES PROTEINES VIRALES

Les virions contiennent de grande glycoprotéines de surface (ou Spicule, S), des protéines intégrées à la membrane (M), lesquelles ont intégrés dans l'enveloppe virale 3 ou 4 segments, une petite protéine membranaire (E), et une protéine de nucléocapside (N).

IV- ORGANISATION DU GENOME

Le génome est constitué d'un unique brin linéaire d'ARN de polarité positive. L'ARN génomique est l'in des génomes viral à ARn les plus grand avec une taille comprise entre 27,6 et 31,5kb. L'ARN des Coronavirus un cap en 5'Terminal suivi d'une séquence Leader de 65 à 98 nucléotides et d'une région non-traduite de 200 à 400 nucléotides (cf figure 3). En 3'terminal du génome se trouve une séquence non-traduite de 200 à 500 nucléotides suivie d'une queue Poly(A). Les fonctions de l'ARN du virion sont de faire les ARNm et de participer à l'infection. L'ARN du virion contient entre 7 à 10 gènes fonctionnels, dont 4 ou 5 codent pour les protéines structurales. Les gènes sont arrangés dans un ordre précis 5'-Polymérase-(HE)-S-E-M-N-3', avec un nombre variable d'autres gènes qui sont apparemment non-structuraux (ns) et souvent non-essentiels, du moins en culture cellulaire. Cet arrangement des gènes s'applique également pour les Torovirus et les Artevirus.
Environ 2/3 de l'ARN viral est occupé par le gène de la polymérase. Au chevauchement (overlap)entre les ORF (Open Reading Frame ou Cadre de Lecture Ouvert) des régions 1a et 1b, il y a une séquence "slippery" (glissante) spécifique de 7 nucléotides et une structure en pseudonœud (signal d'un décalage de lecture ribosomale), qui sont nécessaire pour la traduction de l'ORF 1b. Le tiers restant du génome comprend les gènes codant pour les protéines structurales et les autres protéines non-structurales. L'organisation des gènes des protéines non-structurales, qui sont intercalées entre les gènes des protéines structurales, varie de manière significative selon les différent Coronavirus. Un structure en pseudo-nœud est également prédite en 3'-Terminal de l'ARN des coronavirus.
Les Nidovirales ont été comparés à d'autre virus à ARN+: la majorité des virus à ARN+ peuvent se regrouper dans 2 grands supergroupes: les Picornavirus-like et les Alphavirus-like. Chacun de ces supergroupes est caractérisé par une position ordonnée de 3 domaines conservés formant la colonne vertébrale des polyprotéines réplicatives. Pour les virus du supergroupe des Picornavirus-like, ces domaines inclus une hélicase-ARN (superfamille 2 ou 3), une protéase à cystéine (3Clpro), et une polymérase à ARN ARN-dépendante (RdRp). Pour les virus du supergroupe des Alphavirus-like, ces domaines inclus une methyltransférase, une hélicase-ARN (superfamille 1) et une RdRp. Le plan génétique des Nidovirus basiques inclus une des régions non-traduite en 5' et une région 3' flanquée de 6 à 11 ORFs, certaines d'entre se chevauchant partiellement. Les ORF1a et 1b, les plus proche du 5', sont les plus importantes et se chevauchent. L'ORF1a code pour la polyprotéine pp1a, et ORF1a+ORF1b code directement, grâce à un décalage de lecture ribosomale, pour la polyprotéine pp1ab. Ces deux polyprotéines sont organisées autour d'un cadre de travail (framework) d'une douzaine de domaines réplicatifs et de traitement autocatalytiques de nombreux produits au niveau des jonctions interdomaines. Les autres ORFs, dont le nombre varie selon les virus, sont localisé plus en aval et dirige la synthèse des protéines de capsides et, optionnellemnt, des protéines accessoires. Pour exprimer ces ORFs, une série de d'ARMsgm naissant est générée. Les caractéristiques des différents domaines, en particuliers ceux la réplicase des membres des Nicovirales, ne présentent pas de grande séquences similaires avec ceux des autres groupes de virus. Toutes ces observations sont compatible avec avec la théorie d'une divergence d'évolution entre les corona-, les arteri- et les ronivirales de la racine commune. C'est pour cela que ces familles ont été unies dans l'ordre des Nicovirales (Gorbalenya,2001).

V- LA REPLICATION DES CORONAVIRUS

Figure 4 : Modèle de la réplication des coronavirus

A - Attachement et pénétration:
Bien que les coronavirus puissent s'attacher aux cellules grâce aux formes ubiquitaires acétylées des glycoprotéines et des lipides, une fixation plus spécifique entre le virus et un récepteur cellulaire est requise pour l'établissement d'une infection virale. Les coronavirus sont divisés en 3 groupe. Les membres du groupe 1 des coronavirus (qui comporte le TGEV et le HCoV-229E) utilise l'aminopeptidase N (APN ou CD13) comme récepteur pour l'entrée dans la cellule. Les coronavirus du groupe 2 (qui comporte le MHV), utilise comme récepteurs des membres de la sous-famille des glycoprotéines billiaires (bgp) de la famille des antigène carcinoembrionique (CEA). Les gycoprotéines contenant de l'acide scialique (acide N-acetyl-9-O-acetylneuraminique) sont probablement un composant des molécules de la surface cellulaire requises pour l'infection par BCoV et HCV-OC43. Néanmoins, la fixation aux récepteurs bgp ou APN n'est pas suffisante pour l'infection virale et n'explique pas les différences de tropisme des coronavirus. En plus des récepteurs susmentionnés, un second facteur mis en cause dans la protéine S (peut être un second site de fixation) a été impliqué dans le tropisme des Coronavirus.

B - Traduction primaire:
Pour tous les virus à ARN positif, le premier évènement de synthèse macromoléculaire suivant l'entrée du génome viral dans le cytoplasme est la traduction du génome viral ARN pour produire l'ARN polymérase ARN-dépendante, laquelle est traduite à partir du gène 1. Chez tous les coronavirus, le gène 1 contient 2 ORFs chevauchantes (1a et 1b) lesquels peuvent potentiellement être traduite en une protéine de plus de 700 kDa (rep1ab) grâce à un mécanisme de décalage du cadre de lecture ribosomale (ribosomal frame-shifting mechanism).
Le produit de la traduction primaire est co et post-traductionnellement modifié (process) en multiple protéines par des protéases virales et cellulaires. L'inhibition de la synthèse protéique à certains moments l'infection inhibe la synthèse d'ARN viral., suggérant que la polymérase est probablement traduite tout le long du cycle de réplication. L'ordre des évènement des modifications et les fonctions des produits du gène 1 ne sont pas encore totalement compris.

C - Transcription de l'ARN viral:
L'ARN génomique viral de brin positif est transcrit en un brin d'ARN négatif, lequel est utilisé comme matrice pour la synthèse des brins positifs viraux d'ARNm et de l'ARN génomique. La synthese du brin d'ARN négatif atteint un pic plus tôt et tombe plus rapidement que la synthèse du brin positif. Les cellules infectées contiennent entre 10 et 100 fois plus de brins positifs que de brins négatifs. Bien que des études initiales suggéraient que tous les brins d'ARN négatif étaient de la taille du génome, il est maintenant clair que les cellules infectées contiennent aussi des des brins d'ARN négatifs subgénomiques correspondant en longueur et en abondance relative aux ARNm viraux. Tous les brins d'ARN négatif sont trouvé sous les formes double brin, et aucun brin d'ARN négatifs n'ont été trouvé sous forme libre. Le mécanisme de synthèse et les fonctions des brins d'ARN négatifs subgénomiques et de longueurs génomiques restent encore sujet à controverse. Mais il est clair qu'ils servent d'amorces pour la synthèse d'ARN subgénomiques car les intermédiaires réplicatifs radiomarquées sont composées à la fois des brins complémentaires de longueurs génomiques et subgénomiques. Deux modèles de la synthèse de l'ARN des coronavirus seront discutés plus loin.
Suivant les espèces de virus, il existe entre 5 et 7 ARNm subgénomiques numérotés par odre décroissant. Les ARNm forment une série emboitée avec un 3' commun. Bien que chaque ARNm, excepté le plus petit, soient polycistroniques (contenant 2 ou plus ORF), seule l'ORF en 5'terminal est traduite (avec parfois des exceptions).
Un trait caractéristiques de l'ARNm subgénomiques des Coronavirus est la présence en leurs 5'terminal d'une séquence Leader de 60 à 90 bases identique à la partie 5'terminal de l'ARN génomique. Cette séquence Leader n'est pas présente ailleurs dans le génome, mais entre chaque ORF du génome, on trouve une une petite séquence coeur (short Core Sequence ou CS), hautement conservée, contenant une séquence de 6 et 18 nucléotides homologue avec un séquence proche du 3' final du Leader. Cette CS est incluse dans un domaine plus grand constituant la séquence de régulation de la transcription (Transcription Regulatory Sequence ou TRS). Les 2 modèles favoris pour expliquer comment les ARN Leader sont joint à chaque mRNA et comment les ARNm subgénomiques sont générés sont illustrés ci dessous :

Figure 5 : Modèles de transcription des coronavirus

Le modèle doit etre en accord avec les observations que, tardivement au cours du cycle réplicatif, la taille de la cible des UV de chaque ARNm est similaire à leurs tailles physiques, et que, dans les cellules simultanément infectées par deux virus de souche MHV, approximativement la moitié des ARNm ont un Leader issus d'une souche et codent les séquences de l'autre souche.
Un des modèles pour la synthèse des ARNm de Coronavirus postule une transcription leader-primed (amorcée par le Leader). La transcription de l'ARN Leader commencerait en 3'terminal du brin d'ARN négatif complémentaire et terminerait avec la dissociation du Leader de la matrice, soit seul soit associé à une (des) protéine(s) polymerase. Le Leader fixerait ensuite les séquences intergéniques en aval de de la matrice négative et servirait d'amorce (primer) pour la transcription des ARNm. Ces modèles sont basés sur des études anciennes montrant que les cellules infectées contiennent seulement des matrices de brin négatif de la taille du génome. L'épissage du génome étaient exclu car le taux d'inactivation par les ultraviolet de la synthèse des ARN génomiques et subgénomiques était proportionnel à la longueur de l'ARN. Ceci suggérait que l'ARN Leader était joint au corps de l'ARNm subgénomique durant la synthèse du brin positif. Les points obscurs de ce modèle sont : la cause du point de terminaison de la transcription initial du Leader et savoir si la fixation subsequent du Leader aux séquences intergéniques est médiée par un alignement de séquence d'ARN ou par reconnaissance par l'ARN polymérase. Plusieurs points vont dans le sens du modèle de la transcription leader-primed :

1. Les cellules infectées par le MHV contiennent des ARN Leader libres d'une taille de 60 à 90 nucléotides.
2. Un mutant thermo-sensible du MHV accumule des ARN Leader, mais pas d'ARNm, àtempérature non-permissive.
3. Les Leader transcrits issus de 2 souches différentes de MHV dans une même cellule sont joints au hasard aux ARNm des autres souche.
4. Dans un système de transcription in vitro, dérivé de cellules infectées par le MHV, les ARN Leader ajouté exogénèsement peuvent être incorporés dans les ARNm.

Dans le modèle de transcription leader-primed, le CS sert de promoteur pour la transcription des ARNm. Le CS est conservé chez la pluspart des espèces de Coronavirus. Six ou sept nucléotides à l'intérieur du CS contitue le cœur de la séquence promotrice, et des séquences additionnelles en amont de l'ARN Leader et en 5'terminal des ARN génomiques sont aussi requises pour l'initiation de la transcription. Il exite des variabilités entre différentes souches virales de MHV sur les CS qui précèdent les même ORFs. Certain ARNm, comme l'ARNm 2-1 du MHV, peuvent être transcrit seulement si l'ARN Leader contient une séquence compatible. La séquence Leader de certain ARNm diffère légèrement de la séquence Leader de l'ARN génomique correspondant, suggérant que le processus d'amorçage par Leader requiert des séquences modifiées aux sites de fusion Leader-ARNm. Le modèle de transcription leader-primed est compatible avec la génération d'ARNm issus des matrices négatives subgénomiques et du brin complémentaire, mais le modèle ne tient pas compte de la génération d'observations des ARNs négatifs subgénomiques et des ARN intermédiares de réplication subgénomiques.
Un modèle alternatif pour la synthèse d'ARN des Coronavirus postule une transcritpion discontinue durant la synthèse du brin d'ARN négatif complémentaire. Durant la synthèse du brin d'ARN négatif à partir de la matrice u génomique, la polymérase ferait des pauses sur l'un des CS et sauterait jusqu'au 3'terminal de la séquence Leader à coté du 5'terminal de la matrice d'ARN génomique, générant un ARN négatif subgénomique avec une séquence Leader antisens en son 3'. Ces ARN négatifs subgénomiques et les brins négatifs complémentaires servirait alors de matrice pour une transcription ininterrompue d'ARNm et génomiques positifs. Dans ce modèle, le CS sert de séquence de terminaison de la transcription et/ou de séquence qui interragit avec l'ARN Leader pour permettre les saut de la polymérase durant la synthèse du brin d'ARN négatif. Plusieurs points observées vont dans le sens de ce modèle:

1. Les ARN subgénomiques négatifs ont une séquence poly(U) à leurs extrémités5' et une séquence Leader à leurs extrémités 3'. Ainsi, ils apparaissent comme étant les copies exact et complémentaires des ARNm viraux.
2. La relative abondance des différents ARN subgénomiques négatifs dans les cellules infectées est la même que la relative abondance des ARNm viraux correspondant.
3. Les ARN subgénomiques intermédiares de réplication (R.I.) sont répliqués activement dans les cellules infectées. Lorsque les ARN sugénomiques ont été séparés par taille et dénaturés, les petit R.I. ont généré seulement des petits ARNm, et les grand R.I. ont généré seulement des grand ARNm. Ceci suggère que chaque ARNm subgénomique devrait être transcrit à partir d'une matrice de brin négative de même taille subgénomique.

Les données actuellement disponibles ne donnent pas l'avantage à l'un ou l'autre de des modèles de transcription des coronavirus. Néanmoin, récemment, de fortes évidences concernant les coronavirus favoriseraient le modèle de transcription discontinue durant la synthèse du brin d'ARN négatif (Sawicki et al., 2001). En réalité, ces auteurs ont montré que, en ajoutant des R.I. (Replicative Intermediate RNA) et des R.F. natifs (Replicative Form RNA), les cellules hépatiques de souris infectées par le virus contenaient 6 espèces d'ARN intermédiaires (R.I.) actifs transcrivant des ARNm subgénomiques (sgmRNA). Ils ont nommé ces intermédiares de transcrition (TIs) et les formes transcriptives natives (TFs) car il n'y a pas de réplication de l'ARN de taille génomique.

D - La transcription des ARNm est guidée par l'appariement des TRSs sens et anti-sens:
Récemment, le groupe de Eric Snijder (Leiden, Hollande) a rapporté que les arterivirus (et donc probablement les coronavirus) utilise un mécanisme de transcription discontinue. Durant ce processus, les ARNm générés possèdent l'ARN leader, fusionné en des positions spécifiques en différentes région 3' du génome. En utilisant des clones d'ADNcomplémentaires infectieux issus du virus arterivirus equine arteritis (EAV) et mutés spécifiquement, il a été montré que la synthèse des sgmRNA requiert un appariement de base entre la short Core Sequence (CS) du leader un complement du corps de la CS dans le brin complémentaire négatif. Des mutations dans le corps (body) de la CS du RNA7 de l'EAV réduisent sévèrement voire abolie la transcription de l'(ARN7 subgénomique. La construction de doubles mutants dans lesquels un mutant de la CS leader a été combiné avec le mutant correspondant du corps CS de l'ARN7 amène à une restauration spécifique de la synthèse d'ARN7. L'analyse des jonctions ARNm leader - body sur un grand nombre de mutants rend favorable un mécanisme de transcription du brin négatif discontinue ressemblant à une recombinaison copy choice-RNA (copy-choice RNA recombination).
Le remplacement de C par G dans le Leader et le coprs (body) du gène 7 ( pour générer la CS 5'-UGAAG-3') n' a d'effet détectable sur sa capacité de produire le sgmRNA correspondant. Ceci suggère que la séquence de la CS n'est pas cruciale en elle-même, tant qu'est maintenue la possibilité d'appariement par base de la CS. Si l'on utilise des mutants dans lesquels la CS entiere (5'-UCAAC-3') du leader a été remplacée par une séquence complétement différentes des CS connues (5'-AGUUG-3'), les ARNm subgénomiques ne sont plus produits.

Tableau 3 : Les clones mutants des ADNc complet d'EAV avec leurs substitutions dans le leader TRS
(van Marle et al., 1999)

La mutagénèse du corps due la CS dans certain gène, comme le gène 3 de l'EAV, n'abroge pas la synthèse de l'ARNm3. Ceci a été expliqué par l'identification de 2 espèces majeurs d'ARNm3, l'une(l'ARNm3) dérivant de la séquence consensus de la CS (5'UCAAC-3') et une autre (l'ARNm3.1) derivant d'une sequence non-consensus (5'-UCAAUACCC-3'). Cette dernière contient le résidu C en 5 mais cotient en plus 5 nucléotides en aval ( UACCC-3'). Les mutants en position 5 de ce type ne sont pas affectés par la synthèse de l'ARNm3.1, le C en position 5 n'est indispensable à l'appariement avec la sequence 3' de la CS du Leader, les 5 nucléotides en aval semblant pouvoir remplir ce rôle.
La CS dans les ARNsgm est dérivée exclusivement du corps de la CS. Le mutant B1, et dans une monidre mesure les mutants L1, L2 et B2 produise encore de faible niveau d'ARNm7 (cf tableau). L'ARN7 produit par le mutant B1 a été détecté par hybridation. On a également pu détecté de l'ARN7 produit par les mutants B2, L1 et L2 après de longues expositions et, de manière plus convaincante, par RT-PCR. Dans ce cas là, est ce que c'est la CS qui forme la jonction Leader-body (Leader-corps) de l'ARNm est dérivé du Leader ou de la séquence du corps (body). Parceque la CS du Leader et du corps (body) sont normallement identique, cet question ne peut être résolue en utilisant des souches sauvages. Mais des mutants des construction L1, L2, B1 et B2 ont permis de déterminer l'origine de la sequence à la jonction Leader-body. Celle-ci provient de la CS du corps (body CS) acr seul les mutants B1 et B2 transmettent leurs mutations. Ceci suggère fortement que la transcription discontinue prend place durant la synthèse du brin négatif.

E - La synthèse discontinue des ARN ne dépend pas seulement des appariements entre les TRS leader sens et le corps(body) TRS anti-sens, mais également de la séquence primaire des corps TRS:
L'ARn génomique de L'EAV contient plusieurs séquences qui s'apparie précisement à la TRS Leader, mais qui ne sont pas utilisées lors de la synthèse des ARNsgm. Ceci suggère que la seule similarité entre les TRS Leader et body soit, bien que nécessaire, non suffisante pour la synthèse discontinue des ARN.
pour mieu comprendre ce qu'il se passe, l'équipe de Eric Snijder a réalisé une étude par mutagénèse dirigée du TRS du Leader et du body de l'EAV. Chaque nucléotide de l'EAV ont été substitué avec chacune des 3 autres nucléotides possibles.Chaque mutation a été effectué sur la TRS du Leader, celle du Body de l'ARN7 et celle des deux TRS, réalisant ainsi 54 mutants. Tandis que la TRS du Leader ne joue qu'un rôle de cible dans la translocation du brin naissant, les nucléotides de la TRS du body semble être dans des positions très spécifiques et de nature non-interchangeable.
L'effet d'une seule mutation d'une des deux TRS (body ou Leader) était beaucoup lié à la nature de la base, affectant la synthèse des sgRNA7 de manière variable (cf figure).

Figure 6 : Quantité relative d'ARNsgm7 produite par les mutants EAV de la TRS
(d'après Pasternak et al, 2001)

On remarque qu'aucun changement n'est possible en position 5, où toutes les substitutions de nucléotides abolissent complétement la synthèse d'ARN7. En revanche, dans les postion 1, 2 et 6, certain changements semblent être bien toléré. Pris ensemble, ces résultats suggère que d'autre facteurs, autres que l'appariement Leader-body, jouent un rôle dans la synthèse des ARNsgm et que la séquence primaire (ou la structure secondaire) des TRS pourrait obliger à des préférences de position de base.

F - La transcription chez les coronavirus suit un mécanisme à hautes fréqeunces de recombinaison d'ARN similaire et assisté:
Si le terme de recombinaison est appliqué à l'extension-discontinue durant la synthèse du modèle de transcritpion du brin négatif, la partie donneuse serait la partie du coprs du génome (body), l'accepteur serait la partie Leader de l'ARN génomique et la brin naissant serait le brin négatif synthétisé en discontinu. Nagy et Simon (Nagy & Simon, 1997) ont défini un méchanisme dans lequel le transfert de brin est déterminé par à la fois la séquence similarité des séquences entre les ARN parents et des déterminants ARN additionnels, présent seulement sur un des ARN parentaux. Les résultats des travaux de Pasternak (Pasternak et al, 2001) suggèrent que la synthèse discontinue des ARNsgm chez les nidovirus peut être considérée comme un cas spéciale de haute fréquence de recombinaison asité par des ARN similaires. Alors que la seule focntion de la TRS du Leader est d'assurer la fidélité du transfert de brin par appariement des bases avec la partie 3' du brin naissant, la TRS du body dans l'echantillon donneur possède en plus des fonctions séquences-spécifiques. Une de ces fonctions serait de mettre en pause (ou de terminer) la synthèse du brin naissant et fournir l'opportunité du transfert de brin. De plus, les nucléotides de la TRS du body pourraient jouer un rôle dans la réinitiation de la synthèse du brin naissant sur l'echantillon accepteur.

G - La protéine en doigt de zinc nsp1 est lié à la transcription:
L'expression du génome des virus à ARN+ commence par la traduction plutôt que par la transcription. Pour certain virus, le génome est le seul ARNm viral et l'expression est régulée au niveau traductionnel et par une protéolyse limitée des polyprotéines. D'autres virus, comme comme nous avons vu chez les nidovirus, génère également des ARNm subgénomiques. La transcription des nidovirus n'est pas essentielle pour la réplication du génome. Il a été montré, par Tijms et son équipe (Tijms et al., 2001), que la sous-unité N-terminal de la réplicase, la protéine 1 non structurale (nsp1) du nidovirus EAV n'est pas indispensable pour la réplication mais cruciale pour la transcription, en couplant l'expression de la réplicase et la synthèse des ARNsgm. Nsp1 est composée de deux domaines à protéase papaïne-like (PCPa et PCPb) et d'un doigt de zinc N-terminal prédit, lequel était impliqué dans la transcription par mutagénèse dirigée.L'intégrité structural de nsp1 est essentielle, suggérant que les domaines protéases forme une plateforme pour le doigt de zinc afin qu'il opère dans la transcription.
Le premier produit de la réplication "multiproccessing" de l'EAV est nsp1, une protéine de 260 a.a.qui se libère elle-même co-traductionnellement par une PCPb en sa moitié C-terminale. Pour étudier le rôle de nsp1durant le cycle de vie de l'EAV, un mutant de l'ANDc infectieux de l'EAV knock-out pour nsp1 a été construit.(Marieke et al; 2001). Deux mutants ont été construits:

Figure 7 : Construction des mutants "knock-out" Dnsp1 du virus EAV Arterivirus Equine Arteritis
(d'après Tijms, M. A. et al. 2001)

Chez l'un (D0310), une supression des nucléotides 297 à 1004 aboutit à un arrêt de synthèse des ARNsgm, mais n'affecte pas la réplication du génome. Chez le second mutant (Dnsp1), l'expression de nsp1 a été incativée sans modifier la séquence en 3' du Leader (stem loop). Pour ceci, le codon d'initiation de la traduction (les nucléotides 225 à 227) de l'ORF1a ont été remplacé par AUGAinsi, nsp1 n'est plus traduite et la réplicase démarrer avec nsp2 à partir du codon d'un AUG construit en amont de la séquence codant pour nsp2. Les résultats (cf figure 8)

Figure 8 : nsp1 est un facteur essentiel pour la transcription mais non pour la réplication du génome de l'EAV (d'après Tijms, M. A. et al. 2001)

indiquent que la protéine nsp1, les ARNm (comme l'ARN7) et les ARNsgm sont produit uniquement lorsque celà est nécessaire.
Pour mieu déterminer le rôle de nsp1, la protéine a été produite en utilisant une cassette d'expression sous contrôle d'un IRES (Internal Ribosome Entry Site) introduit en fin de l'ORF21b (figure 9).

Figure 9 : Trans-complementation de la fonction de nsp1 pour la transcription
(d'après Tijms, M. A. et al. 2001)

Une trans-complémentation de la fonction de nsp1 pour la transcription a été observée.
Une comparaison assitée par ordinateur des séquences de la protéine nsp1 d'artérivirus ont révélée la présence d'un motif en doigt de zinc (Zinc Finger ou ZF) , et les 2 domaines protéase (PCPa et PCPb) (figure 10) dans la séquence de nsp1.

Figure 10 : Identification d'un motif en doigt de zinc dans le domaine N-terminal de la réplicase des arterivirus (d'après Tijms, M. A. et al. 2001)

Les motif ZF sont ubiquitaires dans les facteurs de transcription. Une analyse par mutation-délétion de ces domaines a amené à conclure que le motif ZN est utilisé lors de la transcription discontinue. En réalité, une mutation des résidus Cys/His (residus typique des motifs en doigt de zinc) mène à une transcription négative chez ces mutants seulement lorsque l'activité des domaines ZF été détruite.

H - La réplication de l'ARN viral:
Contrairement à la synthèse discontinue de l'ARNm, la production de l'ARN génomique (brin entier positif) requiert une synthèse sans interruption en utilisant des matrices (template) négatives. Ainsi, le mécanisme de réplication de l'ARN et la transcription de l'ARNm subgénomique diffère à certain égard. L'étude de la réplication de l'ARN a été facilitée par DI RNA cloné, lequel peut répliquer à l'aide de la machinerie de réplication fournie par un virus MHV sauvage. La réplication de DI RNA a été utilisée pour déterminer des séquences d'approximativement 400 nucléotides aux extrémités 3' et 5' final de l'ARN génomique. Durant la réplication, la séquence Leader du virus peut être rapidement remplacé par celle du virus helper, suggérant que la réplication de l'ARN implique également une matrice d'ARN libre de manière similaire à la transcription. Cependant, le signal cis-déclenchant (cis-activating) pour la réplication est différent de celui de la transcription. Le mécanisme précis de la réplication de coronavirus reste encore à déterminer.

I - La traduction des protéines virales :
Bien que tous sauf le plus petit des ARNm du coronavirus soient polycistroniques, en général, seul l'ORF en 5 ' de chaque ARNm est traduite.Récemment, quelques exception à cette généralisation ont été découvertes. Comme décris ci-dessus, chez tous les coronavirus, l'ARNm1 contient 2 grandes ORF qui chevauche de 43 à 76 nucléotides et cet ARNm est traduit en une seule polyprotéine par un mécanime de décalage du cadre de lecture (frameshifting). La polyprotéine subirait des modifications (process) co- et post-traductionelle par des protéases virales et de l'hôte amenant à de multiples protéines. Plusieurs autres ARNm des coronavirus sont dicistroniques ou tricistroniques. Par exemple, l'ARN3 de l'IBV (avian coronavirus Infectious Bronchitis Virus) contient trois ORFs légèrement chevauchantes qui sont toutes les trois traduites in vivo et in vitro. La traduction de ces trois ORF est régulée par un IRES en amont qui permet aux ribosomes de dévier (bypass) en amont des ORF et de traduire l'ORF3C par un mécanisme de traduction cap-indépendant similaire à la traduction chez les Picornavirus. La protéine légèrement hydrophobe de 10-12 kd codée par l'ORF3C de l'IBV pourrait être une protéine de l'enveloppe virale appelé E, similaire à la protéine TGEV codée par l'ARNm4 monocistronique et par le second ORF de l'ARNm5 du MHV. L'ARNm5 de l'IBV contient deux ORFqui sont toutes les deux traduites in vitro et in vivo, et une ORF interne avec laquelle le gène N du BCoV (Bovine CoronaVirus) est traduit in vivo.
Le nombre d'ORF codant pour des protéines non-structurales, leurs ordres dans le génome, et leurs mécanismes de traduction diffèrent en proportion des espèces de coronavirus. Les fonctions des protéines non-structurales sont largement inconnues. Plusieurs protéines non-structurales, comme par exemple les gènes 2,4 et 5a du MHV, ne sont pas essentielles pour la production du virus in vitro.

Ce qui est connu à l'heure actuelle:

Le SARS est un typede virus penumonique, dont les symptômes inclus la fièvre, une toux sèche, la dyspnée (détresse respiratoire), le mal de tête, et l'hypoxémie (faible concentration en oxygène dans le sang). Les résultats typiques des laboratoires incluent également la lymphopénie (réduction du nombre de lymphocytes) et des niveaux modérément élevés d'aminotransférase (indiquant des dommages au niveau du foie). La mort pourrait résulter de la perte progressive de respiration due à un endomagement des alvéoles. Le cours clinique typique de SARS comporte une amélioration des symptômes pendant la première semaine de l'infection, suivie d'une détérioration pendant la deuxième semaine. Les études indiquent que cette détèrioration pourrait être liée aux immuno-réactions plutôt qu'à la réplication virale non contrôlée chez le patient

Microspcopie electronique du virus SRAS
(d'après le département de Microbiology & Immunology de l'université de Leicester)

Le virus s'est manifesté en février 2003 dans la province de Guangdong en Chine, où 300 personnes sont tombées malades, et au moins cinq en sont mortes. Après des premiers signes tendant à montrer qu'un paramyxovirus serait responsable, la cause réèle à semblait être un nouveau coronavirus aux propriétés peu communes. D'un coté, le virus du SARS peut posser en cellules Vero (une lignée de cellules de fibroblaste isolée en 1962 chez un primate) - une propriété nouvelle pour les HCoV, lesquels ne peuvent pas être cultivés. L'infection par ce virus sur ces cellules déclenche un effet cytopathe, et le bourgeonnement de coronavirus-comme des particules du réticulum endoplasmique dans les cellules infectées.

Le virus de SARS est connu pour être transmis via des gouttelettes produites par la toux et l'éternuement, mais d'autres voie d''infection peuvent également être impliqués, comme la contamination fécale : dans l'article de Donnelly CA, et al. Epidemiological determinants of spread of causal agent of severe acute respiratory syndrome in Hong Kong. Lancet volume 361, 03 May 2003, les auteurs rapportent que:

• Les symptomes rapportés les plus commun sont la fièvre (94%), avec entre 51 et 72% des patients présentant des symptômes similaires à la grippe, froids, malaise, perte d'appétit, et myalgie (endolorissement d'un muscle, ou d'un groupe musculaire). Les symptômes gastro-intestinaux sont détecté mais moins souvent, y compris la diarrhée (27%), le vomissement (14%), et la douleur abdominale (13%).
• La durée moyenne d'incubation du SRAS serait comprise entre 4 à 6 jours.
• Le taux de cas fatale pour les personnes de moin de 60 ans serait de 2 à 13%, tandis qu'il serait compris entre 3 et 3% pour les plus de 60ans, avec en moyenne un taux de mortalité de 5%.
• Les faisceaux de cas ont joué un rôle important au cours de l'épidémie

L'amplification de petites régions du gène de la polymérase ( la partie la plus conservée du génome des coronavirus) , par RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) et séquençage des nucléotides ont révélé que le virus du SRAS est un nouveau coronavirus qui n'avait encore jamais était détecté dans la population humaine. Cette conclusion a été confirmé par des tests sérologiques. Nous connaissons maintenant la séquence complète (environ 29.700 nucléotides) de plusieurs isolats du virus du SARS. La séquences semble être typique des coronavirus, hors évidemment des structures non-habituelle, bien qu'il y ait quelques différences dans la composition des protéines non-structurales qui sont inhabituelle.

Organisation du Coronavirus associé au Syndrome Respiratoire Aigue Sévère (SRAS ou SARS pour Severe Acute Respiratory Syndrome), (d'après Paul A. Rota et al, Science. 2003 May 1)

Il n'y a pour l'instant aucun consensus sur le fait que des drogues antivirales se soient avérées efficaces dans le traitement contre le SARS ou contre n'importe quelle infection par un coronavirus. Aucun vaccin n'a encore été développé contre le SARS. Cependant, de nouvelles drogues visant spécifiquement ce virus sont en cours de développement. Une cible de ces drogues pourrait être la Proteinase (3CL^pro) dont la structure a récemment été déterminée:

2.54 Å: structure crytallisée de la proteine du HCoV 229E Mpro	HCoV Mpro forme un dimère serré (interface de contact, principalement entre le domaine II de la molécule A et des résidus de NH2-terminal de la molécule B : ~1300 Å) dans le cristal

La réalisation de la structure tridimensionnele de cette protéine a permis de se pencher sur l'élaboration d'inhibiteur du site catalytique de cette protéase: un composé appelé AG7088 (ou p-fluoro-benzyl) serait éventuellement un bon candidat comme inhibiteur de cette protéinase.

La superposition des deux complexes suggère que les chaînes latérales d'AG7088 se liant aux sous-site S1 et S4 pourrait être adapté pour inhiber la protéine M^pro des coronavirus.
(d'après Kanchan Anand et al., Science 13 May 2003)

Les tests diagnostiques pour les infections par des coronavirus sont de deux types:

Enfin récemment, des chercheurs ont trouvé des anticorps du virus provoquant le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) chez cinq professionnels spécialisés dans le commerce des animaux sauvages, mais aucun d'entre eux n'aurait développé de symptômes.
Cette découverte semblerait montrer que la forme du coronavirus qu'on soupçonne avoir franchi la barrière des espèces, soit depuis la civette, soit depuis le raton laveur, vers l'homme, serait moins dangereuse que le coronavirus du SRAS que se transmettent les humains entre eux et qui a fait près de 700 morts parmi les 8.000 contaminés dans le monde.
Après être passé par l'animal, le virus du SRAS subirait des modifications en pénétrant dans le corps humain qui augmentent sa dangerosité, expliquent les chercheurs.

Liens sur le SARS:

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